ALSの治療ターゲット候補 EPHA4
Comments (0) 2012年 9月 1日に筋萎縮性側索硬化症 (ALS) の新規遺伝子 profilin1についての論文をお伝えしました。その論文が発表されたのは 7月15日でしたが、約 1ヶ月後の 8月 26日に、Epha4というタンパク質が ALSの予後と関係していて治療ターゲットになりうることが Nature Medicineに発表されました。
これまでの ALS研究の経緯について簡単に触れると、1993年に家族性 ALSの原因遺伝子として SOD1が同定されて以降、活性酸素除去システムの障害が注目されてきましたが、TDP-43発見が孤発性 ALSを考える上で一つのターニングポイントになりました 。生化学的、あるいは病理学的に大きなブームとして研究される一方で、 FUS/TLS, Optineurin, DAO, VCP, Ubiquilin2などの ALS原因遺伝子が立て続けに見つかり、TDP-43との関連が議論されています。2012年にはフィンランドの孤発性 ALSの約 2割に C9orf72の異常が見つかり、非常に大きなインパクトを与えました (日本人には少ないとされています)。また、孤発性 ALSに対して、ADAR2活性低下と RNA編集異常といった切り口での研究も説得力を持って行われています。しかし、残念なことに、まだこれらは治療に結びつく段階ではなく、「どうやったら病気が良くなるのか、進行を遅らせられるか」についての情報は非常に少ないのが現状です。挙げるとすれば、HGF (2012年 6月に臨床試験への参加条件が変更になっています) や Dexpramipexioleなどが、現時点で注目されるところでしょう。
こうした中、「治療」という観点で、Epha4は今後注目されてくることが予想されるので、前述の Nature medicine論文を紹介しておきたいと思います。
EPHA4 is a disease modifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and in humans
ALSは症例によって予後がかなり違います。家系内での同じ遺伝子変異であってさえ、ばらつきがあります。また、発症年齢も 20~90歳代と幅広く分布しており、遺伝的修飾因子が関係しているものと推測されています。その修飾経路が同定できれば、治療介入のターゲットになるかもしれません。
著者らは、まず SOD1変異遺伝子を発現したゼブラフィッシュで、 morpholinoというアンチセンスオリゴを用いて、ライブラリーに含まれる 303個の遺伝子の翻訳をブロックする実験を行いました。その結果、 SOD1変異による軸索変性をレスキューする遺伝子が 13個見つかりました。最も効果の強かったのが Rtk2でした。Rtk2は ヒトの EPHA4と 67%の相同性があります。Molpholinoで Rtk2のスプライスをブロックする実験でも、SOD1変異による軸索変性レスキューには再現性がありました。また、ヒト EPHA4と 83%の相同性があるサカナ Rtk1パラログを morpholinoにより抑制すると、変異 SOD-1による軸索変性をレスキューしました。
次に、G93A変異を入れたヒト SOD1をマウスに過剰発現させ、Epha4を欠損による効果を調べました。作製した Epha4ヘテロ及びホモ欠損マウスは、脊髄前角細胞数や神経筋接合部の神経支配、筋構造などは正常でした。ただ、Epha4ホモ欠損マウスは、出生第 1週の体重が少なく、出生してくる数も少なかった (※胎生期に問題を起こしている可能性がある) ので、ヘテロ欠損マウスを解析することにしました。その結果、SOD1 G93A＋Epha4ヘテロ欠損マウスでは、ただの SOD G93Aマウスと比べ、ALS発症時期や運動機能は変わらなかったものの、生存期間は延長しました。前角細胞や神経筋接合部の正常な神経支配の割合の評価から、 Epha4のヘテロ欠損は、SOD1 G93Aマウスの運動ニューロン変性を遅らせることが示されました。全生存期間の延長はわずかでしたが、発症後の生存期間は 57%延長し、運動能力の増悪は緩やかでした。
実際に遺伝子ノックダウンをしなくても、2,5-dimethylpyrrolyl benzoic acid という薬剤は、morpholinoを用いたゼブラフィッシュでの Rtk1ノックダウンと同等の効果があり、SOD-1変異による軸索変性をレスキューしました。また、SOD1 G93A変異 ALSラットモデルに Epha4阻害ペプチドを脳室内投与すると、疾患の発症が遅くなり、生存期間も延長しました。
そこで、Epha4欠損が運動ニューロンの変性を抑制するメカニズムを調べました。 Epha4は、SOD1を過剰発現したマウスの脊髄運動ニューロンでは検出されますが、アストロサイトやミクログリアでは検出されません。著者らは、マウスの脊髄運動ニューロンでの Epha4を mRNAレベルで定量しました。すると、SOD1 G93A変異で末期まで残存するような傷害されにくい運動ニューロンでは、Epha4の mRNAレベルが通常の運動ニューロンより低いことがわかりました。また、大きな運動ニューロンは小さな運動ニューロンより傷害されやすいとされますが、大きな運動ニューロンは小さな運動ニューロンより Epha4の発現レベルが高いことがわかりました。マウスでの軸索切断実験では、神経再支配は Epha4の発現量依存的に抑制されました。どうやら Epha4は ALSの神経に対して傷害性に働いているようです。
今度は、ヒトの患者ベースで調べることにしました。2925名の ALSの患者と 9605名の正常コントロールを用いた SNP解析では、EPHA locus周囲 900 kbにある 654の SNPsと ALSの感受性に関係は見い出せませんでした。また、生存率、発症年齢に関連した SNPも見つけることはできませんでした。患者血液の解析では、EPHA4の発現が低いほど発症年齢は高かった一方で、 正常コントロールでは EPHA4のmRNAレベルと年齢に相関はありませんでした。重回帰解析では、EPHA4の発現量が低いほうが罹病期間が長そうだということがわかりました。このことから、EPHA4の発現量が低いと、発症年齢や疾患の進行に影響を与えるようです。
家族性 ALS 96名、孤発性 ALS 96名の Direct sequencingでの解析では、21個の変異がみつかり、9個は既知のもので、12個は新規に見つかったものでした。このうち、種によって保存されている R514X (C1540T), R571Q (G1712A) の 2つを更に調べると、これらは正常コントロールには存在しないものだとわかりました。そして興味深いことに、これらの変異は ALSでの例外的な長期生存に関係しているとわかりました (症例1: 56歳で発症して 89ヶ月生存した孤発性 ALS患者は R514X変異あり, 症例2: 43歳で発症して 149ヶ月生存した家族性 ALS患者は R571Q変異あり)。NSC-43という運動ニューロンの不死化培養細胞に 変異EPHA4を遺伝子導入して解析した結果では、nonsense mutationである R514Xは nonsense mutationのため発現がみられず、missense mutationである R571Qではシグナル伝達機能に異常があり、自己リン酸化の障害がありました。
ここまでの知見から、魚、マウス、ラット、ヒト、全てにおいて EPHA4の発現低下は疾患の重篤性を軽減することが示唆されます。著者らは、疾患修飾因子の SNP解析でこの変異が見つからなかったのは、発現がさまざまな要因で制御されているからだと考えています。
TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) をコードする TARDBPは、まれではありますが家族性 ALSの原因遺伝子であり、TDP-43が神経変性に果たす役割には関心が集まるところです。そこで、Epha4とTDP-43の関連を調べました。ゼブラフィッシュの TDP-43 A315T変異による軸索変性に対する実験で、Epha4ノックダウンあるいは Epha4阻害薬は、軸索の伸長障害や異常な枝分かれをレスキューしました。
最後に、ゼブラフィッシュを用いて、Smn1遺伝子ノックダウンでの運動ニューロン軸索異常に対する Epha4の効果について調べました。Smn1ノックダウンは、下位運動ニューロンを侵す脊髄性筋萎縮症 (spinal muscular atrophy; SMA) のモデルとされています。Epha4欠損および Epha4阻害薬は、Smn1ノックダウンによる軸索の表現型をレスキューしました。これらの知見から、Epha4の阻害による保護効果は神経変性の原因によらないものと推測されます。
Epha4阻害薬については更なる研究が必要です。副作用として現在のところ懸念されるのは、Epha4ホモ欠損マウスで見られたような、長期記憶の障害です。
Ephという受容体型チロシン型キナーゼには、A typeとして Epha 1~10, B typeとして Ephb 1~6が存在することが知られています。ここで紹介した Epha4は Eph A typeのうちの一つです。Eph受容体ファミリーには様々な役割がありますが、今回の論文では、どうやら「軸索反発因子」としての作用を抑制することがキーになってくるようです。
Scientists identify new gene that influences survival in ALS
In an exciting, related development, a new ALS gene (profilin-1) identified last month by UMMS scientists works in conjunction with EphA4 in neurons to control outgrowth of motor nerve terminals. In effect, gene variants at both the top and the bottom of the same signaling pathway are shown to effect ALS progression. Together these discoveries highlight a new molecular pathway in neurons that is directly related to ALS susceptibility and severity and suggests that other components of the pathway may be implicated in ALS.
そして、驚くべきことに、Epha4は先日お伝えした profilin1と協力して働くそうです。今後、Epha4-profilinの系は、目が話せませんね。
今回は内容が難解だったので、専門外の方にもわかるように、まとめをしておきます。
①Epha4というタンパク質が、ALSにおいて悪影響を及ぼしているらしく、ALSでの様々な動物モデル (SOD1, TDP-43異常) で Epha4を働かなくすると神経保護作用が見られた。ALS以外の神経変性疾患モデル (Smn1異常) でも、Epha4をノックダウンすると同様の神経保護効果が見られた。
②ALSで進行の遅い患者を調べたら、Epha4に変異が入って、機能しなくなっていた。
③Epha4は、最近新たに見つかった ALSの原因遺伝子 Profilin1と同じ系で働いているらしい。
④Epha4を抑制する作用のある薬剤 (2,5-dimethylpyrrolyl benzoic acid) は既に知られていて、動物実験にも用いられている。
⑤ただし、Epha4を抑制した場合、長期記憶の障害などが問題になるかもしれない。
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